PCR特异性反应设计引物原则

引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
设计引物应遵循以下原则：
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
5、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6、引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最di引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。