支原体检测试剂盒

公司产品仅供科研使用，下列是产品属性：

商品介绍：

本试剂盒是利用荧光染料检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高(55％～80％)，所以可将其染色而被检测到。被支原体污染的细胞经染色后在细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA染色斑，说明有支原体污染。Hoechst 33258的大激发波长为346nm，大发射波长为460nm;Hoechst 33258和双链DNA结合后，大激发波长为352nm，大发射波长为461nm。

操作步骤：

贴壁细胞：

1.被检细胞接种于无菌的6孔细胞培养板中，接种密度为1-2×104。同时，接种正常无支原体感染的同种细胞，作为阴性对照。

2.5天后，先吸去培养液，再加入1ml的固定液，静置20min，

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液(Hoechst 33258工作液须覆盖全部被检细胞)，37℃避光放置15-20min或室温静置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，加入2ml灭菌超纯水洗涤三次，直接风干。风干后加入一滴封片液，并以盖玻片覆盖。

6.荧光显微镜观察。用紫外激发光激发，观察细胞周围是否有蓝色荧光小点或串珠状荧光小点。

悬浮细胞：

1.收集需检测的细胞，1500rpm，5min。

2.将收集的细胞涂片于载玻片上，再加1ml的固定液，静置20min。

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液(Hoechst 33258工作液须覆盖全部被检细胞)，37℃避光放置15～20min或室温静置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，用无菌水洗涤玻片3次，直接风干。风干后加入一滴封固液，并以盖玻片覆盖。

6.荧光显微镜观察。用紫外激发光激发，观察细胞周围是否有蓝色荧光小点或串珠状荧光小点。
注意事项：

①加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

②使用干净的塑料容器配置洗涤液。

③按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

④底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

⑤洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

⑥使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

⑧试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作程序：

注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。

3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。

4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

6.后固定：消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。

7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。

8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。

10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗

11.滴加化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

13.滴加化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。

14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

15.必要时苏木素复染，充分水洗。

16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)英文名称：8-OHdG ELISA Kit1号染色体开放阅读框194抗体包装1g

70kDa热休克蛋白8(HSPA8)英文名称：HSPA8 ELISA Kit1号染色体开放阅读框198抗体包装25g

70kDa热休克蛋白5(HSPA5)英文名称：HSPA5 ELISA Kit1号染色体开放阅读框21抗体包装5g

70kDa热休克蛋白1A(HSPA1A)英文名称：HSPA1A ELISA Kit1号染色体开放阅读框216抗体包装1g

60kD热休克蛋白(HSPD1)英文名称：HSPD1 ELISA Kit1号染色体开放阅读框43抗体包装25g

5羟色胺转运蛋白(SERT)英文名称：SERT ELISA Kit1号染色体开放阅读框50抗体包装5g

5-羟色胺(5-HT)英文名称：5-HT ELISA Kit1号染色体开放阅读框49抗体包装1g

5-羟基乙(5-HIAA)英文名称：5-HIAA ELISA Kit1号染色体开放阅读框53抗体包装5g

50kDa核孔蛋白(NUP50)英文名称：NUP50 ELISA Kit1号染色体开放阅读框54抗体包装1ml

27kDa热休克蛋白(HSPB1)英文名称：HSPB1 ELISA Kit1号染色体开放阅读框55抗体包装5g

25-羟基维生D3(HVD3)英文名称：HVD3 ELISA Kit1号染色体开放阅读框56抗体包装100g

25kDa突触关联蛋白(SNAP25)英文名称：SNAP25 ELISA Kit1号染色体开放阅读框65抗体包装25g

210kDa核孔蛋白(NUP210)英文名称：NUP210 ELISA Kit1号染色体开放阅读框64抗体包装100g

20S-蛋白体(20S-PSM)英文名称：20S-PSM ELISA Kit1号染色体开放阅读框69抗体包装25g

2',5'-寡腺苷合成1(OAS1)英文名称：OAS1 ELISA Kit1号染色体开放阅读框77抗体包装500g

马氏副球菌Paracoccus│marcusii 质量规格：>99%,BR,三合物胰脂肪试剂盒异槲皮苷;Isoquercitrin

海假交替单胞菌Pseudoalteromonas│marina 质量规格：HPLC>98%,标准品胰抑制试剂盒异鼠李-3-O-新;Isorha

结核分枝杆菌Mycobacterium│tuberculosis 质量规格：>99%,BR胰腺癌标志物CA242 原苏木B;Protosappanin
支原体检测试剂盒枯斑拟盘多毛孢 3--4-甲酰苯酸,95%磷酸二酯2Elisa

硬水黄杆 1-氟吡啶四氟酸盐过氧化物Elisa

热纤梭* ,4,6-基吡啶三氟磺酸盐RecQ解旋样蛋白5Elisa

肺形侧耳 (R)-3-氨基四盐酸盐载脂蛋白AElisa

纤维链霉 乙二二硫代缩氨基脲脂蛋白AElisa

茄链格孢 N-Boc-L-环己基甘氨表皮调节Elisa

丛毛单胞 1-甲基吲唑-4-羧酸Derlin1蛋白Elisa

戊糖片球 Boc-1-氨基环烷甲血清运铁蛋白受体Elisa

布鲁氏 生物Ⅵ型 戊酸钠原钙黏1Elisa

变紫青霉 2--3-甲基-4-(甲基磺酰)雌酮Elisa

尖孢镰刀胡麻专化型 5-氨基-2-三氟颗粒蛋白前体Elisa

梨形毛霉 O,O-二乙基二硫代磷酸, 一般为谷受体2AElisa

屎肠球 庚酸乙酯生长分化因子7Elisa

中慢生华癸根瘤 4,4'-亚甲基-双(3--2,6-二乙基苯)骨成型蛋白8AElisa

枯草芽孢杆 1-(2-苄氧基-4-氟苯基)乙酮生长分化因子6Elisa