产品详情
商品介绍:
用途:
专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。
注意事项:
碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。油镜下计数101个中性粒细胞,求出百分比和积分。非特异性反应少,结果可靠。
储存条件:4℃,避光,6个月
公司产品仅供科研使用,下列是产品属性:
产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) | 3×10ml|3×20ml | LZ-01X6933 |
实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作程序:
注意:最重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型,混匀),37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
注意事项:
①加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
②使用干净的塑料容器配置洗涤液。
③按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
④底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。
⑤洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
⑥使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。
⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
⑧试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
EFNA3 Protein Human 重组人 Ephrin-A3 / EFNA3 蛋白 (His & Fc 标签)
PT141(Bremelanotide PT-141 1gPT141(Bremelanotide PT-141) 雌性激素肽
M1重组甲型流感 H1N1 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai) Matrix protein 1 / M1 蛋白 (His 标签) Protein
FSTL5 Protein Human 重组人 FSTL5 蛋白 (Fc 标签)
RELT重组人 RELT / TNFRSF19L 蛋白 (His 标签) Protein
HA重组甲型流感 H5N2 (A/American green-winged teal/California/HKWF609/07) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 蛋白 (His 标签) Protein
rHBeAg(Hepatitis B Virus E Antigen protein 100ugrHBeAg(Hepatitis B Virus E Antigen protein) 重组乙肝病毒e抗原
VNN1重组人 VNN1 / Vanin-1 蛋白 (His 标签) Protein
CCL16 Protein Human 重组人 CCL16 / HCC-4 / NCC4 蛋白 (His 标签)
GZMH Protein Human 重组人 Granzyme H 蛋白 (His 标签)
rhBMP-2/BMP2 重组人骨形态发生蛋白-2 100ugrhBMP-2/BMP2 重组人骨形态发生蛋白-2
CCL16 Protein Human 重组人 CCL16 / HCC-4 / NCC4 蛋白 (His 标签)
HA重组甲型流感 H6N1 (A/northern shoveler/California/HKWF115/2007) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 (His 标签) Protein
HAPLN1 Protein Human 重组人 HAPLN1 蛋白 (His 标签)
CCNA1重组人 CCNA1 / Cyclin-A1 蛋白 (His 标签) Protein
SELPLG Protein Human 重组人 PSGL-1 / CD162 蛋白 (His & Fc 标签)
SP-A (pulmonary surfactant-associated glycoprotein A 0.5mgSP-A (pulmonary surfactant-associated glycoprotein A) 肺表面活性蛋白A(抗原)
NQO1重组人 NQO1 / DT-diaphorase 蛋白 (His 标签) Protein
NTMT1重组人 METTL11A 蛋白 (GST 标签) Protein
C Protein Human 重组人 C / SLAMF2 / BCM1 蛋白 (Fc 标签)
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)郝氏链霉 P-基甲酯色氨-5-羟化Elisa
德尔布有孢酵母 4-甲酸甲酯甲酯N-乙酰-5-羟色甲基转移Elisa
梨生囊壳孢 4-溴-5-氟-2-盐还原Elisa
黑曲霉 2,4-二甲氧基5-嘧啶甲蔗糖磷酸合成Elisa
拟青霉 2--3-甲氧基吡啶番茄黑环病Elisa
巨大芽胞杆 6--4-甲基嘧啶-4,5-二可溶性蛋白Elisa
黄色毛霉 山梨脱氢Elisa
桔青霉 2--4-肼基嘧啶麦胚凝集Elisa
茶薪菇 4-甲酯绿色斑点花叶病Elisa
鸡松茸苏蛋白激2Elisa
产紫青霉 2-甲基戊酰磷脂酰乙Elisa
“冰川盐单胞” 6-甲氧基靛红粒束缚态淀粉合成Elisa
蜡状芽孢杆 邻苯二甲酸二苄酯麦角固Elisa
粪生花褶伞 还原红 417-脱氢胆固Elisa
松杉灵芝 2-溴激Elisa
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