ZC1609-Y190感受态细胞 生化试剂

Y190菌株是Clontech 公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株,MATa 型,可直接转化质粒或与 MATa 型酵母菌株 Y187 通过 mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验.Transformation marker为:trpl,leu2.cvh2;报告基因为:lacZ,HIS3,MELLY190-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使

用:(pGB和DACT2)或(pGBKT7和pGADT7)。质粒pGB由 pGBKT7改造而来,筛选标志为TRP1 用

于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N 端 1~174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白:质粒 pACT2 与pGADT7 的结构和功能类似,筛选标志为 LEU,用于表达 AD(GAL4C端 768~881位氨基酸)与目标蛋白(Prev)的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)DNA-BD 能够识别 GAL4-responsive gene的上游激活序列 UAS.并与之结合。而 AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的 GAL4 活性,使含有 UAS 的启动子下游基因转录表达。正常条件下.BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白(bait-BD)和prev融合蛋白(prev-AD),如果

bait和prev 发生相互作用,就会促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的 GAL4.从而激活报告基天的转录

操作方法:

1.Carrier DNA 在每次使用前要通过加热处理使其变性为单链状态,步骤如下:Carrier DNA放

95℃水浴或金属浴3min快速插入冰中静置3min再次放95℃水浴或金属浴3min快速插入冰中静置 3min 以上。

*备注:Carrier DNA加入请提前变性处理:95-100℃5min,快速冰浴,重复一次。置于冰浴5min之内使用。

2.取100ul冰上融化的 Y190 感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒 0.5-3ug Carrier DNA 10ul

PEG/LiAc 500ul并吸打几次混匀.30℃水浴 30min (15min 时翻转 6-8 次混匀)。

3.将管放 42℃水浴 15min (7.5min 时翻转 6-8 次混匀)。

4.5000rpm 离心 40s弃上清，ddH,O 400ul 重悬,离心30s弃上清

5.ddH₂O 50ul 重悬,涂板,29℃培养 48-96h。