21060-钙离子荧光探针Rhod-2, AM *CAS

操作步骤

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

       AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。 DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.02％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备1至10μM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5 uM。细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的小探针浓度。

c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，可以在细胞培养基中加入丙*舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以减少脱酯化指标的泄漏。在室温或37°C下用钙指示剂酯孵育细胞20分钟至1小时。

d）在HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如2.5mM丙*舒，如果适用）中洗涤细胞1-2次以除去过量的探针。

e）在所需的Ex / Em波长下进行实验。

2.测量细胞内钙响应：

       为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用等式：[Ca]free = Kd[F - Fmin]/Fmax - F]

       其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。 解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca2 +结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显著。 细胞内指标的原位校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca 2+缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2 +水平。 说明书中的表1列出了一些钙试剂的Kd值供您参考。