钙离子荧光探针Fluo-4 AM *Ultrapure Grade

实验方案

使用钙指示剂AM酯类

1.使用钙指示剂AM Esters加载细胞：

AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）重新配制。 DMSO储备溶液应在-20°C下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯原液。

b）在实验当天，将钙指示剂溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。使用0.04％Pluronic®F-127在您选择的缓冲液（如Hanks和Hepes缓冲液）中制备2至20μM的工作溶液。 对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5 uM。细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。为避免因过载和潜在染料毒性引起的任何伪影，建议使用可产生足够信号强度的小探针浓度。

注意：非离子洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加钙指示剂AM酯的水溶性。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可以将丙*舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中（浓度为1） 丙*舒为-2.5 mM，对于磺吡酮为0.1-0.25 mM，以减少去酯化指标的泄漏。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板室在温度或37℃下孵育20分钟（特别是Fluo-8AM）至2小时，然后将板在室温下再孵育30分钟。

注意1：降低加载温度可能会减少指示符的划分。

注意2：孵育Cal-520 AM超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度

f）用HHBS或您选择的缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙*舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）在所需的Ex / Em波长下进行实验（见说明书）。