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胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)活性试剂盒

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更新时间:2024-05-24

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胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)活性试剂盒

胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)活性试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)活性测定试剂盒说明书 (货号:WS6190F 分光法 48 样) 一、产品简介: 胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPDEC 1.1.1.8)的酶活水平直接决定了葡萄糖分解代谢 过程中向甘油合成方向的物质流分配量,也因此决定甘油的生成水平。 ctGPD NAD 依赖型,催化磷酸二羟丙酮生成 3-磷酸甘油。通过 340nm 下测定 NADH 的下降量,进而得出 ctGPD 的酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 50mL×1 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×3 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,每支分别加 0.44mL 蒸馏水溶 解备用。用不完的试剂分装后-20℃ 保存,禁止反复冻融,三天内用完。 试剂二 液体 37mL×1 4℃保存 试剂三 粉剂 mg×1 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部,加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 三、所需的仪器和用品: 可见分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、可调试移液器、台式离心机、水浴 锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本: 取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g)到研钵内,加入 1mL 提取液,在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本: 先收集细菌/真菌到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌/真菌加入 1mL 提取液; 冰浴超声波破碎细菌/真菌(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000rpm4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例进行提取) ③ 液体样本:澄清的液体样本直接检测,若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测: ① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入下列试剂: 试剂名称(μL测定管 样本 80 试剂一 20 试剂二 640 试剂三 20本试剂盒仅供科研使用 2 混匀后立即在 340nm 处读取 A1 值,5min 后读取 A2ΔA=A1-A2【注】:加完试剂三即启动反应,所以试剂三加完需立即检测,若 A1 超过 1.5 ΔA 超过 0.4,则 减少样本上样量,试剂二相应增加保持原体系不变(如样本上样量减为 40μL ,试剂二 增为 680μL),或减少反应时间 T(如减为 2min)。则改变后的 V1 和反应时间 T 需带入 计算公式重新计算。 五、结果计算: 1、按样本鲜重计算: 酶活定义:每克组织每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 ctGPDnmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(W× V1÷V)÷T=305.5×ΔA÷W 2、按样本蛋白浓度计算: 酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 ctGPDnmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(V1×Cpr)÷T =305.5×ΔA÷Cpr 3、按细胞数量计算: 酶活定义:每 104个细胞每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 ctGPDnmol/min/104cell=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.611×ΔA 4、按液体体积计算: 酶活定义:每毫升液体每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 ctGPDnmol/min/mL=[ΔA×V2÷ε×d×109]÷V1÷T=305.5×ΔA V---加入提取液体积,1 mLV1---加入样本体积,0.08mLV2---反应体系总体积,7.6×10-4 Ld---光径,1cmε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmW---样本质量,gT---反应时间,5minCpr---蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。



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