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磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性试剂盒微板法

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更新时间:2024-05-24

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磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性试剂盒微板法

磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 磷脂酸磷酸酯酶(Phosphatidate phosphatase)活性测定试剂盒 (货号:WS2290W 微板法 96 样) 一、产品简介: 磷脂酸磷酸酯酶也称为磷酸化酶磷酸酯酶(EC 3.1.3.17PPase)是磷酸酯酶中的一种, 在脂类合成的信号传递中发挥着重要作用,其活性对含油量的提高具有重要意义,可作为 育种选择高含油量品种的生化指标。 本试剂盒利用磷脂酸磷酸酯酶(PPase)催化β-甘油磷酸分解产生无机磷分子,通过定 磷试剂测定无机磷增加速率,即可得出磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性大小。 二、试剂盒组成和配制: 【注】:全程需无磷环境;试剂配置最好用新枪头和玻璃移液器等,也可用一次性塑料器皿,避免磷污染。 三、所需的仪器和用品: 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、可调式移液器、研钵、冰。 四、磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性测定: 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验 样本和试剂浪费! 1、样本制备: ① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 10min,取上清,置冰上待测。 【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例进行提取。 ② 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。 2、上机检测: ① 酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 700nm,所有试剂解冻至室温(25℃)。 ② 依次在 EP 管孔板中加入: 试剂名称(μL测定管 对照管 试剂一 200 200 试剂二 50 50 样本 50 35℃ 孵育 30min 试剂三 100 100 样本 50 混匀,12000rpm4℃离心 5min,上清液待测 ③ 显色反应,在 96 板中加入: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 4℃保存 试剂一 液体 40mL×1 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 4℃保存 临用前甩几下使粉末全部落入底部, 加入 11mL 蒸馏水混匀溶解备用。 试剂三 液体 20mL×1 4℃保存 试剂四 A:粉体 mg×1 B:液体 4mL×1 4℃保存 临用前在试剂 A 中加 3.6mL B 液, 再加 46.4mL 的蒸馏水,混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg×1 4℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。 上清液 50 50本试剂盒仅供科研使用 2 【注】若A 在零附近,可增加样本加样体积 V1(如增至 100μL,则试剂一相应减少), 或延长反应时间 T(如增至 1 小时),则改变后的 V1 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算: 1、标准曲线方程:y=0.6161x - 0.0038x 是标准品浓度(μmol/mL, y A2、按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 PPase 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0038)÷0.6161×V2] ÷(V1×Cpr)÷T =26×(A+0.0038)÷Cpr 3、按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 PPase 酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(A+0.0038)÷0.6161×V2]÷(W×V1÷V)÷T =26×(A+0.0038)÷W 4、液体中 PPase 活力计算: 定义:每小时每毫升液体催化产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 PPase 酶活力(μmol/h/mL)=[(A+0.0038)÷0.6161×V2]÷V1÷T=26×(A+0.0038) V---提取液体积,1mLV1---样本体积,0.05mL V2---酶促反应总体积,0.4mLT---反应时间,1/2 小时; W---样本鲜重,gCpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附:标准曲线制作过程: 1. 制备标准品母液(50μmol/mL):标准品用 1mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。 2. 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本 来调整标准品浓度。 3. 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。 试剂四 200 200 混匀,室温静置 3min700nm 下读取各管吸光值, A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。



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